出版于2022年5月25日
细胞培养是一项艰苦的工作。因为这是一个技术含量很高的过程很多事情都可能出错当你从一个来源取出细胞并在另一个来源操作它们时，从污染到生长乏力。
但也有很多事情可以做对。在过去的100多年里，贴壁细胞培养实验为现代医学的一些最具革命性的进步做出了贡献，促进了我们对癌症等疾病的理解，并支持了安全有效治疗方法的开发。
幸运的是，现在人们对文化的了解比以前多得多在体外先驱罗斯·哈里森分析青蛙组织在20世纪初的玻璃片上。在本指南中，我们分享了一个多世纪以来对活细胞进行修修补补的基础知识，包括如何播种、扩增和收获细胞培养物。
低温状态下的细胞播种
在购买细胞培养系时，产品都是冷冻保存的，这是长期保持细胞活力所必需的。在这种状态下，你需要解冻并播种细胞，这是不应该匆忙的，即使它发生得很快。然而，这重要的一步经常做得到匆忙和有时被忽视，其中污染的风险也不能给细胞提供它们所需要的良好的无菌开端。
下面是进行细胞播种过程的正确方法:
- 准备好你所有的补给。你需要一个冷冻保存的小瓶，一个装满预热水的烧杯或水浴，以及一个装有预平衡介质的烧瓶。你还需要一个锥形瓶装满介质，如果你打算向下旋转细胞和去除DSMO或其他冷冻保护剂。
- 加热小瓶。轻轻旋转冷冻保存的小瓶在烧杯预热的水，直到内容物几乎完全融化。然后，用酒精擦拭瓶，以减少污染的风险。
- 播种你的细胞。使用移液管，将细胞从冷冻瓶中取出并转移到烧瓶中。然后，上下移液瓶内的内容物，以混合溶液，便于播种。这样，你的细胞就被解冻、转移，并准备放入培养箱(或离心机去除DSMO)。
随着蜂窝扩展而扩大
当你需要扩大你的细胞时，你需要正确的细胞扩张方法。细胞扩增是细胞培养的一个必要部分，它依赖于效率和一致性。如果你遵循一个低效的工作流程，你可能会推高供应和劳动力的成本。如果你遵循一个不一致的工作流程，你可能会给你的细胞过度压力并杀死它们。
达到正确的平衡取决于你对船只的选择。多层选项，如康宁®HYPERFlask®，可以帮助科学家为生命建立友好的条件在更小的空间里实现更快的增长，同时也减少了人工和污染风险。
因为不是所有的血管都有相同的生长面积，研究人员通常会以细胞/厘米来考虑2当他们决定他们的容器选择和相关试剂的数量时，产量。然后，他们将利用这一点不断地将他们的种子序列进化成研究人员需要的细胞数量。为了获得最佳生长，通过以下操作保持血管和试剂间相同的细胞/cm2和mL/cm2的比例:
- 用这个公式计算你的血管细胞数:[(所需细胞数/厘米)2) * (cm2(指船)。
- 应用这个公式来计算每个容器的介质:[(期望毫升/厘米)2) * (cm2(指船)。为了获得最佳的细胞生长和气体扩散，大多数应用将需要每厘米0.2 mL至0.5 mL的培养基2。
收获你的粘附细胞
当细胞在显微镜下呈单层时，就可以收获了。那时，科学家通常会通过化学或物理手段去除细胞。
通过解离试剂的化学去除需要针对细胞类型和应用进行优化，以确保细胞不受试剂的负面影响。相比之下，通过细胞刮刀物理去除可能是最好的强粘附，敏感的细胞，可能不耐受解离试剂。还要考虑您的下游应用以及解离试剂如何或是否会影响您的研究。
如果您选择使用解离试剂，请使用移液器无菌地遵循此过程:
- 从烧瓶中取出培养基。
- 在烧瓶中加入PBS等缓冲溶液，去除任何可能干扰解离剂的微量血清。轻轻摇晃容器，使里面的溶液均匀。对于难以分离的细胞系，浸泡10到15分钟。除去缓冲液。
- 加入解离试剂，浓度为0.02 ~ 0.03 mL/cm2。根据细胞系或解离试剂，您可能需要在37°C下孵育容器以促进解离。
- 当细胞呈圆形但还没有结块时，它们就已经准备好了——就像你看着布满成千上万颗星星的夜空一样。液体的浑浊是一个好迹象，表明它们已经分离，准备好了。
- 用缓冲溶液或含培养基的血清稀释解离试剂，通常以1:1的比例稀释。上下移液几次，然后取出整个溶液并转移到试管中。
- 如果细胞对该试剂特别敏感，则用离心结束。
现在你的细胞已经可以计数了，这样你就可以测量细胞密度和活力了。
让细胞培养为你工作
贴壁细胞培养可以打开你的实验室实验和下游应用的一个全新的世界-它也可以是有趣的。但当你操纵活细胞时，可能会有很多风险，所以正确操作很重要。通过遵循这些基本提示和工作方式到更先进的协议，你可以成为一个细胞培养专业人士在任何时候。
